腹瀉病一直是世界范圍內(nèi)主要流行和重要的致死性疾病之一，同時(shí)也是導(dǎo)致5歲以下兒童死亡和營(yíng)養(yǎng)不良的第二大原因。不論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，病原體導(dǎo)致的腹瀉是食品安全最主要的問(wèn)題、以及人群健康的重要威脅。另外，雖然人類(lèi)醫(yī)學(xué)條件得到了極大的提升，但因?yàn)楦篂a發(fā)病率高、病原體耐藥率高，使腹瀉病的治療和防控變得愈發(fā)具有挑戰(zhàn)性。

及時(shí)有效地鑒別病原體對(duì)腹瀉的治療和預(yù)后意義重大。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，例如病原確認(rèn)的生化反應(yīng)、顯微觀察和染色、質(zhì)譜鑒定等，均需要對(duì)樣本進(jìn)行培養(yǎng)，從樣本中得到單菌落后才可以進(jìn)行鑒定。該類(lèi)方法缺乏時(shí)效性，主要針對(duì)已知少數(shù)病原體開(kāi)展培養(yǎng)，且不能針對(duì)非可培養(yǎng)的微生物種屬。對(duì)樣本進(jìn)行病原特異基因擴(kuò)增檢測(cè)，還受到樣本背景雜質(zhì)干擾擴(kuò)增反應(yīng)而影響靈敏度、只能檢測(cè)已知病原等的限制。因?yàn)楦篂a病原體種類(lèi)多，尤其在臨床檢驗(yàn)室，還大大受限于操作復(fù)雜和費(fèi)時(shí)費(fèi)力、方法選擇和操作主觀性強(qiáng)等因素的影響，例如對(duì)腹瀉病例進(jìn)行增菌培養(yǎng)分離的方法選擇、菌落挑選等，均造成病原判斷的困難。近年來(lái)，也發(fā)展了16S rRNA基因測(cè)序鑒定微生物種類(lèi)，但該測(cè)序方法只能得到樣本中細(xì)菌的構(gòu)成情況，無(wú)法滿(mǎn)足疾病的診斷和后續(xù)指導(dǎo)治療需求。

宏基因組測(cè)序技術(shù)不依賴(lài)于樣品培養(yǎng)，可以一次性獲得樣本中微生物，對(duì)病原學(xué)診斷具有全覆蓋、高效率等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于臨床病原學(xué)診斷中，例如在腦脊液和血流感染中的應(yīng)用，但在腹瀉病原體鑒定中的應(yīng)用研究還相對(duì)較少。

對(duì)于多數(shù)腹瀉感染個(gè)案，雖在目前階段也需要考慮宏基因組測(cè)序診斷技術(shù)的成本-效益問(wèn)題，但在腹瀉暴發(fā)事件的病原確認(rèn)和防控中，因?yàn)楸┌l(fā)事件社會(huì)影響大，病原導(dǎo)致疾病以及傳播威脅嚴(yán)重，是腹瀉防控、食品安全管理和人群健康保障的重要關(guān)注點(diǎn)，需要發(fā)展更準(zhǔn)確的、非主觀選擇技術(shù)方法準(zhǔn)確鑒定病原，實(shí)施精準(zhǔn)防控。

近日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合黑龍江省疾病預(yù)防控制中心、河南省疾病預(yù)防控制中心的研究人員，通過(guò)對(duì)兩起聚集性腹瀉暴發(fā)事件樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序?qū)ふ夜餐≡w序列，并與傳統(tǒng)使用的病原分離鑒定、病原菌基因擴(kuò)增檢測(cè)方法進(jìn)行比較，系統(tǒng)探索評(píng)估了宏基因組測(cè)序技術(shù)在腹瀉暴發(fā)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，宏基因組測(cè)序在探索腹瀉樣本中的病原體時(shí)，是一種全面系統(tǒng)、無(wú)偏、更靈敏的方法，可為未來(lái)快速診斷腹瀉暴發(fā)中的病原體、乃至進(jìn)一步精準(zhǔn)防控提供技術(shù)基礎(chǔ)和依據(jù)。

主要內(nèi)容

腹瀉暴發(fā)樣品宏基因組測(cè)序及分析

研究收集了2017年地方報(bào)告的兩起聚集性腹瀉暴發(fā)事件樣本，對(duì)每起暴發(fā)案例中的數(shù)份樣本進(jìn)行了宏基因組測(cè)序。在文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序環(huán)節(jié)中，研究人員使用華大智造MGIEasy酶切DNA文庫(kù)制備試劑盒進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，以及華大智造基因測(cè)序儀MGISEQ-200RS進(jìn)行PE100測(cè)序。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析，如圖1所示。研究中同時(shí)與暴發(fā)處置時(shí)應(yīng)用的熒光PCR檢測(cè)致病菌、細(xì)菌分離培養(yǎng)等常規(guī)方法進(jìn)行了比較。 

圖 1. 腹瀉暴發(fā)樣品宏基因組測(cè)序及分析判斷流程。 

案例1樣本分析

應(yīng)用常規(guī)的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)顯示5份腹瀉便樣本中均檢出副溶血性弧菌，諾如病毒及致瀉性大腸埃希菌檢測(cè)均為陰性。宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示，5份腹瀉樣品標(biāo)本均檢測(cè)到了一定豐度的副溶血弧菌核酸序列數(shù)，為291～799，相對(duì)豐度為0.005%～0.012%。但同時(shí)5份樣本均檢測(cè)到了更高豐度的沙門(mén)菌核酸序列數(shù)，為5486～31874，相對(duì)豐度為0.084%～0.797%。糞便樣品中還存在一些常見(jiàn)菌，但無(wú)明確已認(rèn)知的其他致病菌。

根據(jù)此案例分析可發(fā)現(xiàn)，因?yàn)楝F(xiàn)場(chǎng)處置時(shí)根據(jù)可疑暴露食品和經(jīng)驗(yàn)判斷，采用多重?zé)晒釶CR檢測(cè)時(shí)沒(méi)有選取針對(duì)廣泛病原體包括沙門(mén)菌的檢測(cè)試劑，導(dǎo)致沒(méi)有發(fā)現(xiàn)沙門(mén)菌，出現(xiàn)漏診；暴發(fā)中多個(gè)樣本的宏基因組測(cè)序鑒定到所有樣本均含有沙門(mén)菌和副溶血弧菌基因組序列，判斷該腹瀉暴發(fā)事件是由沙門(mén)菌和副溶血弧菌的混合感染所致，這也提示此次疫情食品感染來(lái)源的復(fù)雜性。在鑒定腹瀉暴發(fā)樣本中的病原體時(shí)，宏基因組測(cè)序不需先驗(yàn)知識(shí)進(jìn)行預(yù)判，可以避免引入主觀誤判造成的偏差，并有利于發(fā)現(xiàn)混合感染、變異病原甚至新病原。

圖2. 案例1中5份樣品相對(duì)豐度較高的共有種屬。

案例2樣本分析

疫情處置時(shí)，對(duì)13例病例糞便樣本進(jìn)行了多重?zé)晒釶CR檢測(cè)病原基因，發(fā)現(xiàn)有3例為志賀菌/侵襲性大腸桿菌（EIEC）基因陽(yáng)性。在宏基因組測(cè)序研究中，選擇了3份糞便樣本（包括1份多重?zé)晒釶CR法結(jié)果為志賀菌/侵襲性大腸埃希菌陽(yáng)性、2份多重?zé)晒釶CR法結(jié)果為陰性）進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示3份樣本中均檢測(cè)到一定豐度的志賀-埃希群的核酸序列數(shù)，為2993～153762條，相對(duì)豐度為0.014%～0.649%。未發(fā)現(xiàn)其他致病菌特征序列。由此案例結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在鑒定腹瀉混合感染病原體時(shí)，當(dāng)測(cè)序深度滿(mǎn)足時(shí)，宏基因組方法比傳統(tǒng)方法更靈敏，可檢測(cè)到更多的病原體，更加有效。 

結(jié) 語(yǔ)

當(dāng)前腹瀉暴發(fā)中病原體的確認(rèn)主要依賴(lài)于常規(guī)的分離培養(yǎng)、菌落挑選、生化與血清鑒定、多種病原體的特征基因擴(kuò)增檢測(cè)等，時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、只能針對(duì)已知常見(jiàn)病原，并且方法選擇和判斷主觀性強(qiáng)。宏基因組測(cè)序?yàn)殍b定腹瀉暴發(fā)樣本中的病原體提供了有力手段，不需主觀選擇，靈敏度高，判斷證據(jù)充分得多，雖然因腸道菌群復(fù)雜、對(duì)于腹瀉病例個(gè)案的感染病因病原判斷有一定限制，但在腹瀉暴發(fā)中，由于具有多個(gè)病例樣本間序列數(shù)據(jù)分析的相互驗(yàn)證，因此，為明確病原菌的感染提供了更強(qiáng)的技術(shù)保障。由于具有快速檢測(cè)樣本中整體微生物群落結(jié)構(gòu)的潛力，宏基因組測(cè)序已然成為臨床樣本病原體鑒定和耐藥/毒力基因檢測(cè)的一個(gè)有力工具。尤其在沒(méi)有先驗(yàn)知識(shí)的情況下，宏基因測(cè)序在檢測(cè)病原體上更具顯著的優(yōu)勢(shì)，并在新發(fā)病原體鑒定中發(fā)揮著不可替代的作用。