2022年7月，同濟(jì)大學(xué)高紹榮課題組在Protein & Cell（IF=15.328）雜志在線發(fā)表題為“Bilineage embryo-like structure from EPS cells can produce live mice with tetraploid trophectoderm”的研究論文。該項(xiàng)研究中DNBelab C4單細(xì)胞建庫實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分析均由上海嘉因生物科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱“嘉因生物”）協(xié)助完成，測(cè)序由同濟(jì)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)基于華大智造DNBSEQ測(cè)序平臺(tái)完成。

2022年3月，嘉因生物成為首批華大智造DNBelab C系列高通量單細(xì)胞RNA文庫制備認(rèn)證服務(wù)商。

“本研究展示出嘉因生物單細(xì)胞團(tuán)隊(duì)專業(yè)過硬的實(shí)驗(yàn)技能，也體現(xiàn)出華大智造DNBelab C4單細(xì)胞平臺(tái)的高性價(jià)比和可靠質(zhì)量?！蓖瑵?jì)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)表示。

以下為研究成果*

長(zhǎng)期以來，由于倫理和技術(shù)的限制，對(duì)植入階段胚胎發(fā)育及相關(guān)疾病的研究進(jìn)展緩慢。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的胚胎體外模擬技術(shù)為科研人員提供了良好的平臺(tái)，特別是類囊胚的構(gòu)建很大程度上允許研究人員對(duì)植入前到植入后的連續(xù)過程進(jìn)行操作和觀察。

2019年Belmonte實(shí)驗(yàn)室使用小鼠擴(kuò)展多潛能干細(xì)胞（EPS）構(gòu)建的“擴(kuò)展多潛能干細(xì)胞類囊胚（EPS-blastoids）”結(jié)構(gòu)就是一種同時(shí)包含滋養(yǎng)層（TE）、原始內(nèi)胚層（PrE）和上胚層（EPI）完整原始三譜系的類囊胚結(jié)構(gòu)。但是遺憾的是EPS-blastoids存在嚴(yán)重的植入后發(fā)育缺陷，不能形成有功能的植入后胚胎，這極大地限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。2022年7月15日，同濟(jì)大學(xué)高紹榮課題組在Protein & Cell雜志在線發(fā)表題為 “Bilineage embryo-like structure from EPS cells can produce live mice with tetraploid trophectoderm”的研究論文。該項(xiàng)研究闡述了EPS-blastoids存在植入后發(fā)育缺陷的原因和機(jī)制，并進(jìn)一步進(jìn)行了功能性類囊胚的構(gòu)建嘗試。文中DNBelab C4單細(xì)胞建庫實(shí)驗(yàn)和相關(guān)分析由嘉因生物協(xié)助完成。

文章結(jié)果

作者首先檢測(cè)了不同ES細(xì)胞譜系GBL-1,OBL-4和R11的發(fā)育潛能。對(duì)GBL-1,OBL-4和R11的bulk RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，結(jié)果顯示GBL-1,OBL-4和R11的表達(dá)譜和Deng-EPS cell是相似的（Fig 1A）。用EPS細(xì)胞3D培養(yǎng)成EPS-blastoids，在第4天可與blastocyst直徑相近，達(dá)到約100 μm，到第5天可超過100 μm（Fig 1B）。這些細(xì)胞譜系形成EPS-blastoids的效率在7%-27%，而ES細(xì)胞的效率低于1%（Fig 1C）。用IF檢測(cè)EPS-blastoid和blastocyst中marker: Nanog, CDX2，Gata6的表達(dá)，其中CDX2在blastocyst中的表達(dá)量高于EPS-blastids（Fig 1D）。這些結(jié)果表明，TE-like結(jié)構(gòu)的EPS-blastoid與blastocyst的TE是有區(qū)別的。EPS細(xì)胞發(fā)育成的EPS-blastoid，ES細(xì)胞發(fā)育成的EB都移植在假孕母鼠中，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞能都引起蛻膜反應(yīng)，兩者效率差不多（Fig 1F），EPS-blastoid形成的蛻膜雖然更大，但不能形成胚胎組織（Fig 1G）。

然后作者又比較了EPS-blastoid和EB著床后的發(fā)育潛能，在IVC后培育4天，通過IF檢測(cè)maker SOX17，TFAP2C和Nanog的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EB能發(fā)育出EPI，VE，ExE，EPC，EPs只能發(fā)育出VE-like和EPI-like的結(jié)構(gòu)（Fig 1H&I）。綜上，EPS-blastoids不論在體內(nèi)還是體外都不能進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育。

Fig 1. EPS-blastoids存在植入后缺陷

為了弄清EPS-blastoids不能進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育的機(jī)制，作者利用顯微捕獲切割從ICM結(jié)構(gòu)分離出TE-like結(jié)構(gòu)，通過scRNAseq檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平變化。本次單細(xì)胞RNAseq檢測(cè)，共收集了1094個(gè)TE-like細(xì)胞，1177個(gè)ICM-like細(xì)胞，聯(lián)合分析了blastocyst和EPS-blastoids的已發(fā)表單細(xì)胞RNAseq數(shù)據(jù)。Cell seurat分析細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)這四種細(xì)胞在細(xì)胞亞群上只有數(shù)量差異，沒有類型差異（Fig 2A）。UMAP分析TE-like細(xì)胞和ICM-like細(xì)胞都包含TE，ICM/EPI，PrEsident，但EPS-blastoids還含有兩種中間狀態(tài)（Fig 2B）。對(duì)各亞細(xì)胞群進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)94.42%的TE-like細(xì)胞是PrE相關(guān)細(xì)胞，ICM-like細(xì)胞中只有7.14%的細(xì)胞是PrE相關(guān)細(xì)胞（Fig 2C）。此外，PrE相關(guān)細(xì)胞特異性地表達(dá)Gata6，Gata4，Dab2，Pdgfra，Sox17，不表達(dá)Cdx2。綜上，TE-like的EPS-blastoids主要由PrE相關(guān)的細(xì)胞組成，ICM-like結(jié)構(gòu)是由多種不同譜系的細(xì)胞組成，TE相關(guān)的細(xì)胞主要在ICM-like結(jié)構(gòu)中，不是典型的TE細(xì)胞。

Fig 2. EPS-blastoids的TE-like結(jié)構(gòu)更接近于PrE，而不是典型的TE譜系結(jié)構(gòu)

隨后作者利用SMART-seq2 method檢測(cè)EPS-blastoid積聚過程中細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化，通過觀察這些變化研究TE-like結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制。用到的對(duì)照組是EPSiES，比較的是TE-like結(jié)構(gòu)和ICM-like結(jié)構(gòu)（Fig 3A）。對(duì)blastoid形成中不同時(shí)間點(diǎn)的基因進(jìn)行聚類分析，找到了隨著blastoid形成中逐漸上調(diào)在TE-like結(jié)構(gòu)中也上調(diào)的基因簇，記為group1，和隨著blastoid形成中逐漸上調(diào)在ICM-like結(jié)構(gòu)中表達(dá)上調(diào)的基因簇，記為group2（Fig 3B）。對(duì)group1和group2的基因進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)group1的基因在胚胎TE相關(guān)的譜系EBs中低表達(dá)，在胚胎PrE相關(guān)的譜系高表達(dá)（Fig 3C）；group2的基因在EBs，ICM-like結(jié)構(gòu)中高表達(dá)，在胚胎EPI-related譜系中低表達(dá)（Fig 3D）。

作者通過在PrE，PE，VE，TE，Pluripotency，Ectoderm和Mesendoderm中檢測(cè)Marker的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TE-like結(jié)構(gòu)的形成是PrE相關(guān)細(xì)胞譜系分化的結(jié)果（Fig 3E）。用IF檢測(cè)EPS-blastoids形成中與細(xì)胞全能性和分化相關(guān)的蛋白，細(xì)胞全能性Marker OCT4在D1-3逐漸上調(diào)，隨后慢慢下降；PrE marker SOX17的直徑慢慢增大，有些細(xì)胞中CDX2 取代OCT4的表達(dá)（Fig 3F），說明EPS-blastoid不是真正的TE譜系，只是由分化的PrE相關(guān)細(xì)胞形成的腔狀結(jié)構(gòu)。

Fig 3. PrE相關(guān)細(xì)胞環(huán)繞ICM-like結(jié)構(gòu)，在EPS-blastoids形成過程中膨脹成腔體

因此，作者想找到一組細(xì)胞亞群，這組細(xì)胞存在于EPS細(xì)胞中，與PrE譜系分化特征相關(guān)。為了找到這組細(xì)胞，對(duì)EPS細(xì)胞和ES細(xì)胞進(jìn)行IF，檢測(cè)PrE marker Gata6， SOX17，PDGFα的表達(dá)情況。

作者用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)ES細(xì)胞，LCDM培養(yǎng)下有少量ES細(xì)胞表達(dá)Gata6， SOX17，PDGFα，OCT4，不表達(dá)Nanog；在Li/LIF培養(yǎng)下的ES細(xì)胞只能表達(dá)OCT4而不表達(dá)PrE marker（Fig 4A-C）。定性以后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PrE-like細(xì)胞在ES細(xì)胞中的比例，發(fā)現(xiàn)大約在2%-5%（Fig 4D）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示PrE相關(guān)基因在LCDM培養(yǎng)的EPS細(xì)胞中高表達(dá)（Fig 4E）。

這些結(jié)果顯示，LCDM培養(yǎng)下的EPS細(xì)胞能自發(fā)形成Gata6/SOX17/PDGFα/OCT4的PrE-like細(xì)胞，而這些細(xì)胞的狀態(tài)和PrE譜系早期分化階段是一致的。

Fig 4. LCDM培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)PrE-like細(xì)胞

作者認(rèn)為當(dāng)PrE-like細(xì)胞的比例在EPS細(xì)胞中升高時(shí)，可能可以促進(jìn)EPS-blastoid的形成效率，并對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證。用PrE誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)EPS細(xì)胞2天，然后在EPS-blastoid培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天（Fig 5A），表達(dá)Gata6/SOX17/PDGFα/OCT4的細(xì)胞在PrE誘導(dǎo)后增加了8倍，且PrE marker的表達(dá)量也在轉(zhuǎn)錄水平大幅度增加了（Fig 5B&C）；SOX17/OCT4陽性的結(jié)構(gòu)也增多了，EPS-blastoid的形成效率增加了3倍（Fig 5D）。

在培養(yǎng)基中加入MER signaling的特異性抑制劑PD03后，發(fā)現(xiàn)EPS分化至PrE的過程被阻斷了，EPS-blastoid的形成也被阻斷了（Fig 5E），當(dāng)細(xì)胞傳代5次后，Gata陽性的細(xì)胞顯著減少了（Fig 5F），qRT檢測(cè)到PrE相關(guān)的基因的RNA水平顯著降低了（Fig 5G），這些細(xì)胞幾乎不形成blastoid（Fig 5H&I）。這些結(jié)果顯示LCDM培養(yǎng)基能誘導(dǎo)EPS細(xì)胞分化到PrE，且這一過程有MER signaling參與。

敲除EPS細(xì)胞中的Gata6，發(fā)現(xiàn)敲除Gata6的EPS細(xì)胞與EPSiES細(xì)胞一樣，不能形成blastoid（Fig 5J），和設(shè)想的一樣，EPS細(xì)胞中的PrE，PE和VE的基因都下調(diào)了（Fig 5K）。Gata6敲除后，與未敲除的EPS細(xì)胞相比，有27個(gè)基因上調(diào)，432個(gè)基因下調(diào)（Fig 5L）；與EPSiES細(xì)胞相比，有1010個(gè)基因下調(diào)，1189個(gè)基因上調(diào)（Fig 5M）；Venn分析兩組下調(diào)基因，有303個(gè)基因重合（Fig 5N）。

Fig 5. 依賴于Gata6的PrE-like細(xì)胞對(duì)EPS-blastoids形成是必不可少的

有一小部分BLES是含有PrE和EPI的雙層結(jié)構(gòu)（Fig 6A）。既然EPS-blastoid是因?yàn)槿鄙僬嬲腡E而不能發(fā)育成胚胎的，那么由BLES和tetraploid重構(gòu)的blastocyst能否發(fā)育成成熟胚胎呢？為了驗(yàn)證這個(gè)想法，作者構(gòu)建了GFP標(biāo)記的EPS，收集BLES，重構(gòu)成四細(xì)胞胚胎，移植入假孕母鼠子宮（Fig 6B），從熒光標(biāo)記可以看出BLES能同時(shí)作用于EPI，VE和PE（Fig 6C&D）。

為了驗(yàn)證從blastocyst中補(bǔ)充TE能否支持BLES完成全程發(fā)育，將BLES注射到膨大的tetraploid blastocyst腔室中（Fig 6E），并將重構(gòu)的blastocyst移植入假孕母鼠子宮（Fig 6F）。在胚胎期E7天的時(shí)候發(fā)現(xiàn)大量的綠色熒光出現(xiàn)在EPI，VE和PE中（Fig 6G），最終重構(gòu)的blastocyst能發(fā)育成正常的小鼠。

Fig 6. BLES與四倍體胚胎的TE重新構(gòu)建blastoid能產(chǎn)生可育小鼠

綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)EPS-blastoids由于缺乏真正的TE譜系細(xì)胞而無法實(shí)現(xiàn)植入后發(fā)育，其TE-like結(jié)構(gòu)是由PrE譜系細(xì)胞構(gòu)成的。該研究進(jìn)一步使用包含EPI和PrE譜系細(xì)胞的BLES與四倍體胚胎的TE重新構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了可育小鼠的產(chǎn)生。這項(xiàng)研究為功能性類囊胚的建立提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

* 參考來源：嘉因生物公眾號(hào)